我们将免疫试剂中关键原料提炼出来,分为两块:抗原抗体和特殊成分。
免疫试剂一般可以分为两个过程:免疫反应和显色反应。免疫反应是核心,将待测物特异性地从复杂样本中分离出来,这一环节的好坏,直接决定整个试剂的核心质量。
在工业生产上,免疫检测用的抗体,一般是通过工程菌表达抗原片段,免疫动物,进行多克隆或者单克隆抗体制备,然后得到的抗体,进行配对筛选,选出合适的配对应用于免疫检测。在这个过程中,由于待测抗原一般都是天然抗原(少数科研检测重组抗原),而制备和筛选抗体一般又是使用重组抗原,因此会带来很多应用问题,这个对抗体制备商来说,值得重视。
免疫反应做为一个脆弱的非共价键结合过程,整个反应受时间、干扰物、桥联物、结构类似物等影响,为消除这些不良影响,一般在缓冲体系中会增加一些特殊成分,这些特殊成分我们定义为次要原料,在工艺中详述。
工艺包含配方体系和工艺流程,两者相辅相成。所有的配方和工艺,是为保障和提高产品性能而设计的,当原料无法满足产品性能要求时,如何通过配方工艺来提高,或者说,哪些性能能通过配方工艺来提高,如何来提高,哪些只能由原料决定,这个在我们研发职业生涯中,要不断积累与完善。
配方体系可以拆解为缓冲体系和改进体系。
(1)缓冲体系 一般的缓冲体系,在教科书、产品说明书、论文中均可见到,主要包含离子对类型、离子浓度、pH值等内容,非保密配方,比较容易理解与掌握。
(2)改进体系 因为免疫反应的非共价键结合的脆弱性,依靠一个简单缓冲体系,要获得很好的反应结果,是比较困难的,针对这种问题,科学家设计了各种改进体系,这些体系下面,又有各种方法产生。
A、降低本底体系
使用合适的包被、标记浓度,一般采用棋盘滴定确定。
加入增加溶解率,降低非特异吸附的物质,如曲通、吐温。
B、减少干扰体系
加入正常鼠血清或者鼠IgG,降低人抗鼠抗体影响
加入阻断剂,降低类风湿因子干扰
C、减少前带效应体系
适当提高包被和标记浓度,兼顾本底
加入检测抗体裸抗,兼顾灵敏度
D、增加灵敏度体系
加入曲通、吐温等
加入特殊物质,如S19
E、提高检出率体系
多个抗体联合使用,如CnTI项目
F、提高稳定性体系
缓冲液加入保护性蛋白、糖类、小分子化合物
G、等等其他体系 随着研究深入,这个目录会不断增加,相应的方法也会不断增多。
工艺流程,又包含生产工艺流程和试剂盒检测操作工艺流程两个方面。
(1)生产工艺流程 生产工艺流程,对整个的产品性能,有非常大的影响,比如预包被板制备工艺,包被、封闭、干燥的温度、时间,对整个性能影响很大,需要研发摸索。
(2)检测操作工艺流程 相比生产工艺,试剂盒的检测操作工艺,对性能影响更大,一步法、两步法,加样量,加样顺序,温育温度,温育时间。
我们分析原料与工艺,就是为了找到一个合适的研发思路,指导研发过程,提高研发效率,整个研发思路,我们再划分为产品研发和改进研发两个问题。
产品研发是一个从无到有的过程,多数是根据市面上已有的试剂,研发自己公司没有的产品。这个过程占研发的大头,我们再将其细分为初步研发、预临床实验和稳定性测试三个过程。所有的研发,我们都必须知道,一个性能项目,他是怎么评估的,哪些因素会影响这个性能,如何改进,我们以双抗体夹心为例列举。
(1)初步研发 初步研发时,一般重点强调三个活性成分:包被抗体、检测抗体、校准品。包被抗体和检测抗体,会有一个经验浓度,校准品一般用合适基质,将抗原或者高值样本进行梯度稀释,获取的梯度浓度进行第三方赋值,追溯到国际、国家或者企业标准品。
初步研发多数是在做配对筛选,只需要用检测限、线性范围、可报告范围这三个性能评估项目,即可筛选出候选配对。比如拿到10株抗体,可以做成100个配对,进行筛选,选出初步可用的候选配对若干对。
对初筛的候选配对,进行精密度、准确度(回收实验)、干扰实验评估,通过这些实验,再二次筛选候选配对。
(2)预临床实验 不涉及临床血清样本的初步研发都完成后,获得一定的候选配对,进行预临床实验,主要是评估准确度(方法学比较)和参考值区间。
(3)稳定性测试 通过上面两个步骤,试剂盒初步成型,活性组分(包含预包被板、校准品、酶标抗体)的稳定性,需要一一评价与改进,直到满足要求。
整个试剂盒的研发,最终就是为了检测临床血清样本,所有的分析性能评估项目,也是为这个目的而设计,但是在整个研发过程中,不管是预临床试验,还是正式临床试验,配对测试的临床血清样本量,是非常有限的,顶多就算是完成一个小试生产。到真正产品上市和临床应用时,随着样本量的扩大,很多之前没有暴露的问题,都会集中暴露,必须收集足够数据,进行改进研发。
一般这个阶段,就是针对临床不符合的样本,特别是假阳性、假阴性样本,要对样本进行不同厂家试剂检测比对,成分分析等等,这个过程在预临床和正式临床都会做,在预临床和正式临床时,还要对检测值严重不符,但并未导致假阳、假阴性的样本,进行分析。