呼吸道病原体快检赛道!CRISPR等新技术汇聚,革命正当时!
来源: IVD从业者网 2022年06月21日 10:23

此前,中国疾病预防控制中心在顶级期刊Nature communications发布了一项来自106个城市、277家哨点医院和92个参考实验室,历时11年的呼吸道传染病监测数据。在完善急性呼吸道感染的主动监控网络的同时,确定引起中国人群的急性呼吸道感染的病因及其流行病学特征。这份来自国内呼吸道传染病相关的大数据将常见的感染性病原体进行了系统的分析,也为呼吸道疾病的检验提供了参考。

病原体检测和确证是呼吸道传染病疫情防控的首要环节,呼吸道疾病往往起病比较急,因此快速、准确的检测就显得尤为重要。目前常用的检测方法有基于检测病原体特异性基因的核酸检测技术、基于检测病原体抗原或抗体的免疫检测技术等,不同的技术各有优势。

王升启教授的《呼吸道传染病病原体快速检测新技术与研究开发重点》一文提到常见的呼吸道传染病病原体检测新技术和研究方向主要有以下几个趋势:

(1)热门的病原体核酸检测新技术

基于核酸扩增的技术具有灵敏、特异、快速等突出优点,被广泛用于病原体检测和临床疾病诊断。目前最常用的核酸检测技术为聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增技术、基因芯片技术等。

1. 双链基因探针实时荧光PCR:实时荧光PCR是目前国际公认的病原体检测应用最广泛和稳定的分子检测技术,在呼吸道传染病病原体实验室确证中具有不可替代的地位和作用。如获批国家注册证的新冠病毒核酸检测产品中,90%以上采用的是实时荧光PCR技术。探针是实时荧光PCR技术的核心,根据荧光探针结构的不同,可分为以下几种:水解探针、分子信标探针、杂交探针、蝎型探针及复合基因探针等,其中,复合基因探针具有荧光具有背景低、灵敏度高的突出优势。


图1. 复合基因探针的原理图
2. 基于CRISPR的核酸检测技术:近年来,CRISPR/Cas技术飞速发展,基于该技术发展的分子检测方法具有快速、灵敏、特异、廉价等特性,已广泛应用于生命科学领域,尤其在病原体检测领域发展迅速。
目前用于呼吸道病原体检测的主要有CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13等系统。CRISPR/Cas13检测系统,张锋等开发了一种基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技术,为SARS-CoV-2提供了快速准确的诊断方法。通过使用合成的SARS-CoV-2的RNA片段,设计并检测了2个可识别SARS-CoV-2特征的sgRNA,激活Cas13酶活性,切割报告分子,产生信号(图3)。该技术最后需要将试纸条浸入反应体系中,通过辨识条带位置的不同来确认是否感染SARS-CoV-2。

图3. CRISPR/Cas13检测系图3. CRISPR/Cas13检测系统
诺贝尔奖获得者Doudna等报道了一种CRISPR/Cas13a和手机直接检测新冠病毒的RNA的方法,这是一种简便且便携的检测方法,实现从采样到检测的一体化。该装置通用小型精简的手机摄像头进行荧光测试。此外,因为手机摄像头具有高灵敏度、强连接性以及GPS和数据处理功能,所以这是一种可以应用到资源匮乏地区的实用工具,有助于即时检测(图4)。


图4. 基于手机的CRISPR/Cas13核酸检测系统

3. 基因芯片新技术:基因芯片又称为DNA芯片、DNA微阵列,是生物芯片的一种,也是生物芯片技术中发展最成熟、最先进入应用和实现商品化的技术。
基因芯片技术是直接将DNA探针或者在固相支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等)上原位合成寡核苷酸固定于支持物表面,然后与待分析的标记样品杂交,标记的样品通过于基因芯片上已知碱基序列的DNA片段互补杂交,从而得到样品的遗传信息,确定样品的核酸序列,或对基因表达量及其特性进行分析。
当前,大多数基因芯片的显像和分析方法都是基于有机荧光染料的激发荧光,该方法成熟、简便,能够达到一般的检测要求,但有机荧光染料有自身难以克服的缺点:光淬灭、信号强度低、光谱重叠等,从而影响到检测信号的灵敏性、均一性和重复性,信号检测也依赖激光共聚焦扫描仪,体积笨重,价格昂贵。我国在临床诊断用生物芯片产品研发领域处于国际领先地位,但生物芯片技术仍然没有发挥其应有的应用价值。
为解决生物芯片技术检测灵敏度低、操作步骤多、易污染等突出问题,我国研究者发明了高灵敏可视化生物芯片技术,研制出一种新的纳米金复合底物Nanogold-DAB,HRP能够直接催化此复合底物反应导致大量纳米金颗粒特异沉积,从而建立了一种生物芯片的纳米金复合底物高灵敏可视化检测方法,
图6表示了新型底物Nanogold-DAB的反应原理:纳米金的NHS基团与DAB的一个氨基缩合反应形成酰胺键而得到Nanogold-DAB产物。该技术通过酶催化和银离子还原显色2次信号放大,灵敏度比传统方法提高10倍以上。
同时,创新设计全封闭防污染芯片结构,成功研制了全新的自动化生物芯片检测仪,实现了扩增、杂交、检测和分析一体化。基于可视化生物芯片技术研制的流感病毒分型基因芯片获得了首个可视化生物芯片产品的注册证书。

图6. Nanogold-DAB复合底物反应原理示意图
二、免疫检测新技术
免疫层析检测技术以其操作便捷、成本低廉、检测快速的特点,已广泛应用于各类样本中的小分子、生物大分子、病毒、细菌的快速检测,成为目前应用范围最广的即时检测技术之一。
纳米标记材料是影响免疫层析检测性能的关键,常用材料包括胶体金、荧光纳米材料等。胶体金是免疫层析检测技术最常用的检测标签,其检测结果肉眼可见,无需使用读数设备,适用于现场定性检测。荧光纳米材料包括有机荧光染料、量子点、上转化发光纳米粒子等,具有多通道定量检测能力,其中量子点免疫层析、表面增强拉曼光谱免疫层析等新技术发展迅速。
1. 量子点免疫层析新技术:量子点(Quantum dots,QDs)是一种2~20nm尺寸的半导体纳米材料,由于量子尺寸效应而具有带隙能和荧光能尺寸可调的性质。典型的量子点材料为CdSe/ZnS核-壳结构,ZnS外壳可钝化CdSe内核表面,防止内核氧化或分解。
与传统的有机荧光探针相比,量子点具有无光致漂白作用,性质稳定,高量子效率;吸收光谱宽,发射光谱窄,可由单一光源激发多种波长量子点,具有多通道检测能力的优点。采用量子点标记检测代替传统的胶体金标记技术,可实现具有高灵敏、多通道、定量检测能力的荧光免疫层析技术。

2. 表面增强拉曼光谱(SERS)免疫层析技术:拉曼光谱是一种表征分子结构振动的指纹光谱,在表面科学、材料表征、痕量检测、生命科学方面有着广泛应用前景。
20世纪70年代,Fleischmann、Van Duyne和Creighton等发现吸附在粗糙银电极表面或附近的分子的拉曼信号得到极大提高,即表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)。多种贵金属增强基底可使吸附于其表面的分子SERS信号比普通拉曼信号增强104~107倍,并且贵金属纳米缝隙及纳米尖端附近电磁场发生共振耦合,形成热点(hot spot)效应,能够产生强烈的SERS增强效应。
最近报道了磁免疫富集SERS免疫层析检测呼吸道病毒的应用。单分散的Fe3O4磁核表面以带正电的聚乙烯亚胺静电吸附大量纳米金颗粒作为种子还原一层银壳,吸附拉曼报告分子,并共价偶联修饰甲型流感病毒和腺病毒的抗体。功能化的磁性SERS标签可实现从复杂样本中免疫结合、磁富集病毒颗粒,并结合免疫层析试纸条,实现快速高灵敏的SERS检测。通过磁富集和SERS增强双重机制,使检测限比胶体金法降低了2000倍
文章摘自:王升启教授《呼吸道传染病病原体快速检测新技术与研究开发重点》
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