受理号：CSZ1900206

体外诊断试剂产品注册技术审评报告

产品中文名称：乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）

产品管理类别：第三类

申请人名称：北京热景生物技术股份有限公司

国家药品监督管理局

医疗器械技术审评中心

基本信息

一、申请人名称

北京热景生物技术股份有限公司

二、申请人住所

北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地天富街 9 号 9 幢

三、生产地址

北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地天富街 9 号 9 幢

技术审评概述

一、产品概述

(一) 产品主要组成成分

本试剂盒由 A 盒（磁珠法核酸提取试剂）和 B 盒（扩增反应试剂）组成，主要组成成分见表1。

具体内容详见产品说明书。

（二）产品预期用途

本试剂盒用于体外定量测定人血清样本中的乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）。

已有研究数据显示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝内 HBV 病毒的转录活性，在部分血清中HBV DNA 低于检测下限的样本中，HBV-RNA 仍可以被检测到。同时，在NAs治疗中，血清HBV-RNA 可辅助作为 HBeAg 转阴的预测的指标之一，血清 HBV-RNA 结果为阴性，需要结合其他指标共同用于指导 NAs 的治疗。该检测结果不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。本试剂盒不得用于 HBV 的血液筛查。

（三）产品包装规格

48 人份/盒。

（四）产品检验原理

本试剂盒（PCR-荧光探针法）采用磁珠法提取血清中的 HBV-RNA。特异性地检测 HBV-RNA 的保守区域。检测试剂内含有一条反转录引物、一对特异性扩增引物以及一条荧光探针，与 RT-PCR 反应缓冲液，Taq 酶，逆转录酶等共同配制成 RT-PCR 反应液，在实时荧光定量 PCR 仪上进行一步法 RT-PCR 扩增，实现对血清样本中 HBV-RNA 的检测。

二、 临床前研究概述

(一) 主要原材料

1. 主要原材料的选择

本产品的主要原材料包括：引物、探针、假病毒、RT-PCR 反应体系（包括 10×RT-PCR Buffer（含 dNTPs）、逆转录酶和 TaqDNA 聚合酶混合液）、磁珠法核酸提取试剂等，这些原材料均是通过外购方式获得。其中，引物和探针均为申请人自行设计，由专业的合成公司合成和纯化后获得。

申请人从有资质的供应商中，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商。制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。

2.企业参考品设置情况

该产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品、检出限参考品、准确度参考品、样本线性参考品、核酸提取功能参考品，参考品采用临床样本制备而成。组成如下：

阳性参考品共 10 份，分别命名为阳性参考品 P1~P10，来源于 HBV-RNA 阳性样本，涵盖B型、C型和D型。

阴性参考品共10份，分别命名为阴性参考品 N1~N10，涵盖正常人样本、巨细胞病毒、EB病毒、人类免疫缺陷病毒1型、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和梅毒样本。

精密度参考品共 2 份，分别命名为精密度参考品 J1~J2，采用 HBV-RNA 阳性样本梯度稀释而成。

检出限参考品 1 份，命名为检出限参考品 S1，采用 HBV-RNA 阳性样本稀释而成，浓度为 300copies/mL 。

准确度参考品共 5 份，分别命名为准确度参考品 Y1~Y5，采用 HBV-RNA 阳性样本梯度稀释而成，浓度分别为2.0×107copies/mL、 2.0×106copies/mL 、2.0×105copies/mL 、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL。

样本线性参考品 1 份，命名为样本线性参考品 L，采用 HBV-RNA 阳性样本稀释而成。

核酸提取功能参考品共 12 份，分别命名为核酸提取功能参考品 T1~T12，其中 T1~T8 采用含内源性干扰物质的 HBV- RNA 阳性样本稀释而成，T1、T5、T9 含血红蛋白，T2、T6、 T10 含甘油三脂，T3、T7、T11 含总 IgG，T4、T8、T12 含 总胆红素，T9~T12 为阴性血清样本。

以上临床样本采用数字 PCR 法和实时荧光 PCR 法进行确认。各企业参考品用于产品准确性、特异性、检出限、精密度、线性、核酸提取功能等的检测。

本试剂盒设置了阳性质控品和阴性质控品，用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。此外，每个样本均检测 1 个 内标，用于评估核酸提取和 PCR 扩增的质量和结果的判读。

(二)生产工艺及反应体系研究

申请人对试剂盒反应体系的研究包括对 HBV-RNA 特异性引物/探针浓度的确定、内标引物/探针浓度的确定、反应液的选择、反应体积的确定、核酸提取试剂的确定、DNA 酶 I 的用量确定等；对反应条件的研究包括 PCR 退火温度、扩增循环数、扩增反应时间，DNA 酶 I 的作用温度和时间的筛选和优化；对样本用量、内标用量、核酸提取液体积等进行了研究。

申请人通过功能性实验，确定了最佳的反应体系。并根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。

（三）分析性能评估

该产品分析性能评估内容包括核酸提取功能、检出限、线性范围、准确度、精密度、分析特异性（交叉反应、干扰物质）、HBV DNA 干扰浓度等。申请人提交了有效运行的质量管 理体系下生产的三批产品在 3 种适用机型（ ABI Prism7500、LightCycler480、杭州博日 9600plus）上的性能评估资料。

在核酸提取功能评估中，申请人使用含有 28mg/dL 总胆红素、22g/dL 血红蛋白、3000mg/dL 甘油三酯、40g/L 总 IgG 的 HBV-RNA 阴性血清样本稀释已知浓度的HBV-RNA 强阳性样本，制备成高、低浓度样本进行研究，结果表明以上干扰物质对核酸提取性能无影响。

在检出限的性能评估中，申请人对 HBV-RNA 临床血清样本（B 型、C 型、D 型）和 HBV-RNA 假病毒样本（A 型、E 型、F  型、G 型）进行梯度稀释，采用三批次试剂对系列浓度样本分别进行 20 次重复检测，以≥95%阳性检出率的最低稀释浓度作为检出限，最终确定该产品检出限为 300copies/mL。采用三批试剂对 HBV-RNA 临床血清样本（B 型、C 型、D 型）和 HBV-RNA 假病毒样本（A 型、E 型、F 型、G型）进行检出限的重复性检测验证，符合检出限的性能要求。

在线性范围的性能评估中，申请人采用不同基因型的样本，分别制备 9 个浓度的样本进行线性范围研究，产品在1.0×103copies/mL~1.0×108copies/mL 范围浓度呈线性相关，线性相关系数 r＞0.9800，符合线性范围的性能要求。

在准确度的性能评估中，申请人采用 HBV-RNA 阴性样本对阳性样本进行系列稀释，分别制备成 2.0×107 copies/mL、2.0 × 106 copies/mL 、2.0 × 105 copies/mL 、2.0 × 104 copies/mL、2.0×103 copies/mL 共 5 个梯度样本进行准确度研究，结果表明检测浓度的对数值与理论浓度的对数值的绝对偏差不超过±0.5个对数数量级，符合准确度的性能要求。

在精密度的性能评估中，申请人对高、中 2 个浓度的 HBV- RNA 精密度样本进行检测，分别对批内、批间检测结果进行分析，结果表明精密度样本的变异系数均不高于5%，符合精密度的性能要求。

分析特异性研究包含交叉反应和干扰研究。交叉反应的性能评估中，申请人对人巨细胞病毒、EB 病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人类疱疹病毒 6 型、单纯疱疹病毒 1 型、单纯疱疹病毒 2 型、甲型流感病毒、丙酸痤疮杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌样本进行交叉反应评价。结果显示，上述样本与本产品均不产生交叉反应。

干扰研究实验中，申请人采用在中低浓度的 HBV-RNA 样本中加入干扰物质的方法进行验证，拉米夫定（1.3μg/mL）、阿德福韦酯（21.24ng/mL）、恩替卡韦（3.46μg/mL）、替比夫定（3.69μg/mL）、普通 IFNα（2020pg/mL）、聚乙二醇干扰素α（10.88μg/L）、总胆红素（≤28mg/dL）、甘油三酯（≤3000mg/dL）、血红蛋白（≤22g/dL）、总 IgG（≤ 40g/L）及不高于 2×107 IU/mL 的 HBV DNA 对本产品检测结果均不产生干扰。

（四）阳性判断值或参考区间研究

本产品的阳性判断值研究，采用乙肝感染者的血清样本（B 型、C 型、D 型）及不同人的阴性血清样本共 249 例，使用本试剂盒进行阳性判断值研究，对检测靶标 Ct 值进行 ROC 分析，确定其阳性判断值为靶标 Ct≤26。通过对 HBV DNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性及 HBeAg 阳性/阴性样本的靶标进行 Ct 值分析，HBV DNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性及 HBeAg 阳性/阴性对靶标阳性判断值的判定无影响。

本产品预测 HBeAg 转阴的阳性判断值研究，采用 79 例慢性HBV感染者（B 型、C 型、D 型）队列血清样本（0 周、48  周、5年），使用本试剂盒进行检测，对检测结果分别计 算 B、C、D 型的 ROC 曲线和最佳预测 cutoff 值，结果显示 均不具有显著差异；将 B 型、C 型、D 型样本合并共同用于确定预测治疗 5 年后 e 抗原转阴的最佳 cutoff 值为 708copies/mL。此时的 PPV 为 81.8%，NPV 为 87.0%。

（五）稳定性研究

申请人对本产品的实时稳定性、开瓶及冻融次数限度稳定性、运输稳定性进行了研究，同时，对样本的稳定性也进行了研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。

实时稳定性：将三批次试剂的 A 盒置于 10~30℃，B 盒 置于-20 ± 5℃的条件下保存，连续 7 个月对试剂盒的外观、阴阳性符合率、检出限、线性、准确度、精密度进行考察，各项性能指标均符合要求，确定产品在规定的储存条件下，可稳定保存 6 个月。

此外，申请人对产品的开瓶及冻融次数限度稳定性、运输稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均满足产品说明书声称的要求。

三、临床评价概述

申请人在首都医科大学附属北京佑安医院、兰州大学第二医院、沈阳市第六人民医院共 3家机构完成了临床试验，对考核试剂检测人血清中 HBV-RNA 的临床准确性和临床有效性进行验证。

(一)临床准确性验证

采用考核试剂与参比方法对临床样本进行比较研究试验的方法验证本产品的临床准确性。入组样本为慢性 HBV 感染者、其他肝脏疾病干扰样本以及非肝脏疾病的正常人血清样本，共计 1033 例。参比方法选择 ABI QuantStudio 3D芯片数字 PCR 系统。

临床准确性研究在 3 家临床单位共检测了 1033 例血清样本，实际纳入检测 1033 例，包括慢性 HBV 感染者样本 709 例（68.64%），其他肝脏疾病干扰样本 78 例（7.55%），非肝脏疾病的正常人样本 246 例（23.81%）；675 例有分型结果的样本中，B 基因型 160 例、C 基因型 464 例、D 基因型 51 例。

对1033例入组血清样本进行考核试剂和参比方法符合率分析，阳性符合率  99.26%（95%CI：98.11%~99.80%）、阴性符合率98.99%（95%CI：97.65%~ 99.67%）、总体符合率 99.13%（95%CI：98.35% ~ 99.60%）；Kappa（K）=0.983，考核试剂和参比方法具有较好的一致性。

相关性分析显示考核试剂和参比方法的线性相关系数 r=0.9864 ，回归分析得出的线性回归方程为 y=0.9854x+0.1123，其中截距 a 的 95%的置信区间为[0.0255，0.1992]，斜率 b 的95%的置信区间为[0.9693，1.0015]。

对 675 例有基因分型数据的样本检测结果进行分析。B 基因型血清样本，考核试剂与参比方法定量检测结果的相 关系数 r=0.9873，线性回归方程为 y = 0.9973x + 0.0083，截距 a 的 95%置信区间为[-0.1876，0.2042]，斜率 b 的 95%置信区间为[0.9625，1.0321]；C 基因型血清样本，考核试剂与参比方法定量检测结果的相关系数 r=0.9853，线性回归方程为 y = 0.9876x + 0.1229，截距 a 的 95%置信区间为[0.0161，0.2296]，斜率 b 的 95%置信区间为[0.9672，1.0080]；D 基因型血清样本，考核试剂与参比方法定量检测结果的相关系数r=0.9918，线性回归方程 为 y = 1.0241x - 0.1546，截距 a 的 95%置信区间为[- 0.4375，0.1290]，斜率 b 的 95%置信区间为[0.9748，1.0732]。考核试剂与参比方法的定量检测结果（lgcopies/mL）之差在±0.5 范围内。

综上所述，申请人考核试剂与参比方法检测结果一致。

(二) 临床有效性研究

本研究中分别对考核试剂定量检测血清 HBV-RNA 用于预测 NAs 治疗患者 HBeAg 转阴、HBV DNA 低浓度的 CHB 患者中HBV-RNA 的检出率进行临床有效性研究。

1.考核试剂定量检测血清 HBV-RNA 用于预测 NAs 抗病毒治疗患者 HBeAg 转阴研究

采用考核试剂对来源于回顾性队列样本的 78 个患者（接受 NAs 抗病毒治疗的 HBeAg 阳性慢性 HBV 感染者）的共 624 例血清样本进行 HBV-RNA 定量检测，每个患者采集 8 个标本， 分别对应治疗前和治疗中的 8 个不同检测点：即 NAs 抗病毒 治疗第 0 周、24 周、48 周、1.5 年、2 年、3 年、4 年、5 年。 优选治疗第 48 周血清样本中的 HBV DNA、HBV-RNA 定量值用 于预测治疗五年后（一个治疗周期）HBeAg 转阴的受试者工作特征曲线（ROC）分析和这些定量值对 HBeAg 转阴的预测值分析。

分析结果显示，NAs 药物治疗的 78 例 HBeAg 阳性患者中，治疗 48 周 HBV DNA 定量和 HBV-RNA 定量预测 NAs 药物治疗五年后  HBeAg 转阴的曲线下面积（AUC）依次为 0.736 和 0.874。

HBV DNA 以 156.0 IU/mL 为阈值独立预测治疗 5 年 HBeAg 转阴的阳性预测值为 60.9%，阴性预测值为 84.4%；HBV-RNA 以 708 copies/mL 为阈值独立预测治疗 5 年 HBeAg 转阴的阳性预测值为 80.6%，阴性预测值为 83.3%。HBV-RNA 在治疗 48 周后预测五年 HBeAg 转阴的预测价值优于血清 HBV DNA 的预测价值。

2. HBV DNA 低浓度 HBV 感染者中 HBV-RNA 检出率研究

本次临床试验共包含 374 例  HBV DNA  低浓度（＜500IU/ml）或未检出样本，其中 HBV DNA 阴性 227 例。在 HBV DNA 阴性样本中，HBV-RNA 检出阳性 145 例，阳性检出率为 63.88%（145/227）；在 374 例 HBV DNA＜500IU/mL 的慢性 HBV 感染者样本中，HBV DNA 检出阳性 147 例，阳性检出率 39.30%（147/374），HBV-RNA 检出阳性  249  例，阳性检出率66.58%（249/374），χ2=54.26，P＜0.05，具有显著差异。 可见在 HBV  DNA 低浓度或未检出的慢性 HBV 感染者中，HBV-RNA 具有较高的检出率。 

综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术审评要求。

四、产品受益风险判定

(一) 受益评估

本产品可用于对乙型肝炎病毒感染的辅助诊断，也可以 对 NAs 的治疗效果作出预测。我国乙型肝炎患者比较多， NAs 治疗可以提高乙型肝炎患者的治愈率，单独检测 HBV DNA 可能存在漏检风险，研究表明，通过对 HBV DNA 已经 检测不到的患者进行 HBV-RNA 的检测，可以辅助对患者病情进行监测。

(二) 风险评估

该试剂盒已知和可预见的安全风险主要有以下几个方面：

1. 与预期用途有关的安全风险，例如本产品的检测结果非患者病情评价的唯一指标，未结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。

2. 与生产有关的安全风险，例如使用未经过验证或检验不合格的原材料。

3. 与运输与储存有关的安全风险，例如试剂的运输和储存超出规定条件。

4. 与使用有关的安全风险，例如使用仪器和试剂时没有按照说明书要求进行操作。

5.  生物危险，例如直接丢弃使用后或失效的产品或产品使用过程中产生的废弃物未按照医疗废弃物统一销毁处理。

通过对乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR- 荧光探针法）从生产原材料、配制、检测、包装、运输、储存、使用方法及安全注意事项、保存和用后处理等全过程危害判定、风险估计、预防化解，从产品技术要求和使用说明书及企业规章制度对产品质量的全过程控制和风险防范措施，已将产品的安全风险系数降到了验收准则规定的可接受范围内，同时采取降低风险的措施后没有引入新的风险。在目前认知水平上，认为该产品上市带来的受益大于风险。尽管目前认为该试剂盒的受益大于风险，但是为保证用械安全，基于对主要剩余风险的防控，已在该试剂盒说明书中提示以下信息：

1.预期用途：

本试剂盒用于体外定量测定人血清样本中的乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）。

已有研究数据显示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝内 HBV 病毒的转录活性，在部分血清中 HBV DNA 低于检测下限 的样本中，HBV-RNA 仍可以被检测到。同时，在 NAs 治疗中， 血清 HBV-RNA 可辅助作为 HBeAg 转阴的预测的指标之一，血 清 HBV-RNA 结果为阴性，需要结合其他指标共同用于指导 NAs 的治疗。该检测结果不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。本试剂盒不得用于 HBV 的血液筛查。

2.警示及注意事项：

该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检验方法的局限性及注意事项。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册。申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第 680 号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（原国家食品药品监督管理总局令第 5 号）等相关医疗器械法规 与配套规章，经系统评价后，建议准予注册。

2022 年 11 月 10 日

附件：产品说明书