运输成本>试剂成本?冻干技术破解分子试剂冷链困局!
来源: IVD从业者网 2022年12月01日 17:04
   分子诊断冻干技术  




这几年分子诊断检测的冻干形式是一个大趋势,尤其是越来越多的企业开始开拓海外市场,诊断试剂盒需要通过运输出口。

传统的液体分子检测试剂,因其中含有生物活性的酶,为保证试剂在运输和保存过程中的稳定性,都需要通过干冰或蓝冰的冷链运输,运输成本高,储存在实验室冷柜里即占空间也耗电费,要是出口时遇到海关扣检查验,环境温度变化的话容易造成检测试剂反复冻融,会直接影响试剂的性能和保质期。而将试剂干燥通过常温储运则可以有效地解决这些问题。
液体分子检测试剂干燥的方法有冻干和风干两种。冻干技术已经比较成熟且运用广泛,风干技术是可以解决冻干技术局限性的另一种干燥方法,两者各有优缺点,具体本文不做赘述本文将重点介绍分子检测中冻干技术的应用冻干原料选择
01
分子试剂冻干技术

冻干是通过冷冻干燥(freeze-drying)的方法将液体中的水分移除,这是一个多步骤的过程。

冷冻干燥是一个精细的过程,必须彻底控制才能达到所需的产品质量。完整的冷冻干燥过程分为四个阶段:

1
预处理
冷冻前的产品准备。包括:
1)选择合适的容器(八连管、西林瓶、96板孔等)。
2)考虑样品中的活性成分的热和化学特性,注意需要什么样的冷冻温度,以及活性成分是否对pH值变化敏感。要确定样品中存在的任何溶剂在该特定浓度下可以经历适当的冻结。
3)添加赋形剂,如在固体含量低的溶液中添加膨松剂以稳定饼状结构,或添加塌陷温度调节剂以提高货架温度,使诊断试剂更安全、更快地升华。
2
冷冻
将产品冷却至三相点。这对于确保在接下来的步骤中升华而不是熔化非常重要。在此步骤中,冰晶的形成取决于速度和冷冻温度。形成的晶体的大小影响冻干速度和最终产品的孔隙度。大冰晶是首选, 冷冻设置温度-50℃至-80℃。

注:根据经验,冰晶越小,加工时间越长。重要的是,由于冰的形成而产生的冷冻浓度会导致pH值的变化以及随后的构象和结构变化。冰晶会对活性成分施加机械压力,包括破坏蛋白质膜。为了缓解这个问题,可以尝试使用冷冻保护剂。
3
初级干燥
一旦有了冷冻样品,就可以继续进行初次干燥,压力降低并向冷冻品提供热量以升华冰,材料中约95%的水分被去除。

这一步为了避免由于冷冻样品中的高水含量而引起的塌陷,依然需要保持较低的温度。为了优化处理时间,可以使用终点测定技术跟踪升华处理。可以检查样品温度的变化或监测测量压力的变化,这取决于干燥室中升华的蒸汽量。
4
二次干燥
去除剩余的未冻结的水。有些产品需要减压,但有些产品可能会受益于此阶段增加的压力。产品的最终残留水含量在 1% 和 4% 之间。
5
封装
冻干后的试剂很强的吸湿性,因此从冻干机中取出产品时,必须小心避免暴露在环境湿气中。湿度受控的房间或隔离设备可用于减缓水分的再吸收。试剂必须密封在防潮容器中,例如铝袋,避免存储期间吸潮影响性能。
# 冻干小贴士 #

在样品批量装载到冻干机的过程中,控制产品的蒸发和产品温度会是一个问题,特别是对于具有较大批量的较大装置,完全装载需要比较长的时间。对搁板进行预冷会降低上述问题带来的影响。

冻干过程取决于足够的热量传递到产品中。大多数96孔是塑料管,底部与冷冻干燥机搁板接触的表面积很小。在冷冻干燥过程中可以使用铝制冷却块来增加传导热传递。

对流传热在冻干中也很重要,因为它可以帮助产品在货架上更均匀地分配热量,减轻由辐射传热差异引起的边缘效应。在产品支持的前提下,使用更低的真空度(例如:100mTorr 而不是 60mTorr)可提供更均匀的对流传热。

许多PCR试剂的塌陷温度非常低,因此冻干过程中设置较高的压力可能并不总是可行的。可以在配方中添加赋形剂,提高塌陷温度,以允许更高的压力设置。这样做的其他好处包括使配方更容易转移到其他可能无法实现非常低真空设置的冻干机(减少工艺放大的风险),以及减少阻塞流现象发生的概率。


常见的冻干制剂形式有:

1)西林瓶冻干

2)PCR管或板孔里的在位冻干
3)冻干微球

各种形式的形态与优缺点总结



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液氮冻干微球


由于液氮冻干微球的种种优势,包括更方便用于微流控平台,这两年关注度大大增长,我们也收到很多技术咨询,这里小编特地多做几句介绍:

通过液氮预冻可以以极快的冷冻速度最大限度地减少冷冻浓度效应,例如pH变化。然而,它也会带来非常小的冰晶尺寸,这会导致在干燥过程中对蒸汽流动的阻力更大并且干燥时间更慢,小样本量可以降低这方面的影响,但需要冻干机提供更冷的搁板温度和更低的真空度来防止珠子在初级干燥过程中熔化。

此外,珠子必须保持冷冻。可以使用冷藏的冷盘来辅助。冷冻干燥机搁板也需要预冷,以避免产品在抽真空之前熔化。要注意的是在产品室门在真空下密封之前,预冷冻搁板会导致环境条件下结霜。冷冻干燥的颗粒或珠子通常放置在PCR管中,然后密封在防潮袋中。

冻干微球对原料和保护剂的要求特别高,迈迪安全线的冻干试剂都可以用来做滴氮冻干,而无需额外添加赋形剂,我们即用型的预混液中已经有优化的冻干赋形剂,完全可以满足滴氮冻干的操作需求,已经有优化的冻干方案,并且通过客户的成功验证。欢迎有兴趣的厂家联系我们订购试样。

02
冻干原料的选择

液体分子核酸检测试剂中因为含有生物活性酶,为了保护冷冻保存中酶的活性不受反复冻融的影响,一般是添加甘油作为保护剂,但是甘油是不可冻干的。因此可冻干的分子检测体系需要选择无甘油酶。

但是,并不是简单的去除掉液体体系中不可冻干的成分就可以做冻干了,因为无甘油酶的冻干后的稳定性和活性都有可能变化,因此体系中各组分(包括缓冲液的pH值、盐浓度、保护剂等)需要重做优化,还要添加冻干赋形剂,来保证在各种冻干条件下(包括冷冻、温度梯度、真空和脱水)冻干试剂的性能和结构的稳定性,并且冻干后酶可以被快速水化,且酶活性能(灵敏度和特异性)不受影响。

目前基础酶国内很多国内厂家都可以做到,但在基础工艺的研究,工艺风险和批间差的控制、以及大量需要时间验证的实验数据,与国外原料大厂存在着差距,而且这些短板是无法用速度和规模来弥补。

这些技术上的差距,都会在产品质量上反映出来:批间一致性、小样和大样性能差异、存储及运输过程稳定性、缓冲溶液和保护剂相容等等问题。很多的验证都需要足够的时间,才能累积到数据,才能逐渐形成和构建出核心竞争力。

行业内卷严重,竞争激烈,很多厂家将还没等到足够的数据时,就被淘汰。选择合适可靠的原料可以降低冻干项目的研发风险,缩短研发周期,降低研发成本。

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