分子诊断:多技术共存,高速协同发展
来源: IVD从业者 作者: 未来智库, IVD从业者 2020年10月02日 18:13

分子诊断:多技术共存,高速协同发展

分子诊断是应用分子生物学方法,通过检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传 物质的结构或含量的变化而做出诊断的技术。其检测对象主要为核酸和蛋白质,以核 酸分子为主,相比于发展成熟的免疫诊断、生化诊断等技术,分子诊断处于快速成长期,是体外诊断(In Vitro Diagnosis, IVD)领域发展最快的细分领域,具有检测时间 短、灵敏度更高、特异性更强等优势,被广泛应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性 疾病、肿瘤伴随诊断等领域。


分子诊断技术的发展经历了四个阶段:

1)第一阶段:20 世纪 80 年代基于核酸分子杂交技术的遗传病诊断;

2)第二阶段:20 世纪 90 年代聚合酶链式反应(PCR)的问世将分子诊断技术推 向更精准、更高效的阶段特别是发展到第二代的荧光定量 PCR(qPCR)和第三代的 数字 PCR(dPCR);

3)第三阶段是基于基因芯片的多指标、高通量基因检测;

4)第四阶段是基于基因测序技术在 NIPT(无创产前诊断)、遗传性肿瘤筛查及肿 瘤精准治疗等方面的应用。

 

国内分子诊断起步较晚,发展速度高于全球。在精准医疗、个性化用药等需求推动下, 分子诊断技术在全球得到飞速发展,根据火石创造数据显示,2013-2019 年全球分子 诊断市场规模由 57 亿美元增长至 113.6 亿美元,年复合增长率为 12.18%,主要市 场玩家包括罗氏、雅培、西门子、强生等。国内分子诊断虽然起步较晚,但在消费升 级、政策扶持以及资本青睐等多重因素推动下,已经由产业导入期步入成长期。2013- 2019 年,我国分子诊断市场规模由 25.4 亿元增长至约 132.1 亿元,年复合增长率达 到 31.63%,虽然仅占全球市场规模的 16.86%,但是增速约为全球增速的 2.6 倍, 主要企业包括达安基因、凯普生物、华大基因、贝瑞基因、艾德生物等。

分子诊断领域主要包括 PCR(qPCR 和 dPCR)、二代测序技术(NGS)、荧光原位 杂交(FISH)、基因芯片等,其中 PCR 是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台,在国内分子诊断中市占率为 40%,在国内获批的分子诊断产品中,基于 PCR 技术的超过 90%。


与杂交技术和测序技术相比,PCR 技术主要优势在于高灵敏度、易 于推广,主要局限在于检测位点单一且已知,多重基因联合检测时可涵盖的基因数量 受限,目前已经发展到第三代数字 PCR(dPCR),短期内仍将是分子诊断主流技术 平台;测序技术发展迅猛,虽然市占率较低但市场增速最快,其中二代测序技术 NGS (高通量测序)是目前测序领域应用最广泛的技术,已经成为许多序列变异分析与科 研应用的主要选择,但由于实验操作复杂、成本高等原因,在临床应用中仍处于起步 阶段,应用前景广阔。

 荧光原位杂交技术(FISH)

FISH 是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术,主要用于指 导肿瘤靶向药物使用、肿瘤预后、肿瘤疾病分型诊断等领域,是检测 HER-2 基因状 态的金标准,目前在大多数省份和地区已经纳入医保。

FISH 全称荧光原位杂交技术, 原理是利用已知的 DNA 变异序列,与被检测的样本 DNA 序列杂交、互补配对,从 而发现样本 DNA 的异常情况,主要用于了解基因或染色体是否发生扩增、缺失、融 合或断裂,检测样本来源广泛(组织、脱落细胞、羊水、血液、骨髓等),且不仅限 于新鲜样本,2-3 年的石蜡样本都可以检测;同时,FISH 检测成本较低而且在大多 数省份和地区都被纳入医保范畴。FISH 应用最多的场景是 DNA 扩增检测,《2014 年 NCCN 乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌 HER2 检测指南 2014 版》均指出 FISH 是 检测 HER2 基因状态的“金标准”,目前 Roche、Abbot 等研发的 HER-2 扩增检测 试剂盒已获得 FDA 批准。

基因芯片技术

基因芯片技术又称 DNA 微阵列技术,是将大量已知 DNA 序列做成探针,集成在同 一芯片上与标记样品分子进行杂交,从而获得样本序列信息,可以实现对大量目标 基因同时进行检测,具有成本相对较低(比如微基因的 WeGene检测套件仅 599元)、 检测效率较高的优势,主要应用于消费级基因检测、病毒分型、耐药突变位点检测、 遗传基因和肿瘤基因检测等领域。相比基因芯片产业在发达国家的高速发展,我国基 因芯片行业市场尚处于起步阶段,代表企业包括赛乐奇、博奥生物、百奥科技、达安 基因等,目前获批的基因芯片诊断试剂盒主要应用在 HPV 病毒基因分型、乙肝病毒 基因分型和耐药突变位点检测、肿瘤基因突变等领域,获批的基因芯片相关仪器较 少。在国家相关政策和终端需求不断扩大的推动下,我国基因芯片技术已经进入产业 化探索阶段,根据沙利文数据显示,中国基因芯片行业市场规模从 2014 年的 35 亿 元增长至 2018 年的 95.1 亿元,年复合增长率为 28.4%。

1.2 PCR:分子诊断主流技术平台,临床诊断“金标准”

PCR(聚合酶链式反应)是指利用 DNA 聚合酶(如 Taq DNA 聚合酶)在体外条件 下,催化一对引物间的特异 DNA 片段合成的基因体外扩增技术。PCR 是生物体外 的特殊 DNA 复制,最大的特点是能将微量的 DNA 大幅扩增。以实时荧光 PCR 技术 为例,通过 PCR 技术进行分子诊断的主要流程包括:

1.核酸的提取和纯化:使用核酸提取试剂从病毒、细菌等中提取出 DNA;

2. 核酸在引物约束下特异性的 PCR 扩增:在提取的 DNA 中加入扩增需要的反应 液(酶、复制需要的原料、引物等),在 PCR 仪中完成扩增过程;

3. 扩增产物的检测:通过荧光标记法检测 DNA 含量,从而判断病毒 DNA 含量,给 出诊断结果。

PCR 技术最大的特点就是灵敏度高、特异性好、及时方便,在基础研究以及医学诊 断、法医学和农业科学等各大领域应用广泛。在临床诊断中,PCR 技术具有诸多优 势:灵敏度高,靶细胞检出率可达 1/100 万,病毒检测灵敏度≥3RFU,最小细菌检 出率为 3 个,检测样本纯度要低,仅需 DNA 粗提取;扩增反应在 2-4 小时内完成, 使用简便、快捷。作为临床诊断的“金标准”技术,PCR 广泛应用于血站核酸检测、 疾控核酸检测、临床核酸检测等领域,其中,在传染病诊断和血筛检测中,PCR 技 术能缩短诊断的“窗口期”并且可以定量对病原体进行检测,相比于传统的免疫诊断 方式,具有不可替代的优势,基于 PCR 技术的分子诊断是医院对传染病诊断的“金 标准”。

PCR 经过三代技术更迭,精确度和灵敏度不断提高PCR 技术最早由穆勒于 1985 年发明,经历了第一代定性 PCR、第二代定量 PCR 和数字 PCR 三代技术迭代,其 中第二代定量 PCR 包括荧光定量 PCR(qPCR)以及在其基础上分化出来的 ARMS (突变扩增阻滞系统)和 HRM(高分辨溶解曲线)。三代技术的主要差异如下:

Ø 第一代定性 PCR 技术:采用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 扩增产物进行分析,存在 交叉污染、检测耗时长、只能做定性检测等缺点,目前处于衰退期,已基本被淘 汰;

Ø 第二代荧光定量 PCR(qPCR)技术:qPCR 在一代定量 PCR 的基础上引入荧光探针标记法从而实现定量检测,目前发展最成熟、应用最广泛、临床普及率高, 为现阶段主流应用平台,正处于从成长期向成熟期过渡的阶段,市场增速在 20% 以上;

Ø 第三代数字 PCR(dPCR)技术:dPCR 是在 PCR 原理的基础上利用芯片和荧 光检测技术进行核酸绝对定量检测。芯片技术是 dPCR 的核心工艺,利用对样 品进行分液处理进而实现“单分子模板 PCR 扩增”,达到定量检测的目的,具 有更高的精确度和灵敏度,目前处于导入期,市场增速在 10%-15%。

 

 

二代 PCR:主流分子诊断平台,伴随诊断和感染性疾病领域为主

qPCR(荧光定量 PCR)是目前应用最成熟、临床应用最广泛的技术平台qPCR 在 国内外均为分子诊断临床应用最广泛的技术平台,尤其是在感染性疾病(病毒性肝 炎、性病和其他病菌/病毒类等)和肿瘤伴随诊断领域,目前仍以 qPCR 技术平台为 主。据不完全统计,截至 2020 年 5 月 11 日,国家药监局共批准了 806 个 PCR 类 产品,其中荧光定量 PCR(qPCR)产品占比高达 85.11%。在伴随诊断领域,NMPA 获批的伴随诊断产品中有 60%都是基于 qPCR 技术,而 FDA 批准的 39 个伴随诊断 产品基于 qPCR 技术的产品占比也高达 38.46%(15 个)。

 


 国内 PCR 行业竞争激烈,不同细分领域龙头效应显著。二代 PCR 技术门槛相对较 低,国内获批的 PCR 检测产品数量多、竞争激烈,主要企业包括达安基因、艾德生 物、凯普生物、之江生物、硕世生物、透景生物、圣湘生物等。


从获批的 PCR 检测试剂盒数量维度看,达安基因拥有 38 种基于 qPCR 技术的检测试剂盒取得 NMPA 的批文;从不同细分应用领域维度看,各家产品线重合度较高,尤其是优生优育、性 传播疾病、HPV 检测等领域竞争激烈,但艾德生物、凯普生物、亚能生物凭借多年 在不同细分领域的先发优势、技术积累以及渠道优势等分别在伴随诊断、HPV 检测、 地中海贫血检测领域处于绝对领先地位,其中凯普生物在 HPV 检测领域占据 1/3 市 场份额,艾德生物在 PCR 伴随诊断领域具有绝对领先优势。 

第三代数字 PCR(dPCR):应用前景广阔,未来发展趋势

 qPCR 相比,dPCR 优势包括:灵敏度高(可以达到单个核酸分子)、无需标准曲 线或参照基因进行对比来测量核酸量、适合环境复杂样品的检测、能够有效区分浓 度差异微小的样品。dPCR 在国内尚处于起步阶段,目前仅有南京科维思生物的 HER2 基因扩增检测试剂盒(数字 PCR 法)获批,在肿瘤伴随诊断、肿瘤早筛、传 染病检测、NIPT、药物基因组学等领域具有较大临床应用潜力和优势。根据沙利文 数据显示,中国 dPCR 行业市场规模从 2013 年的 14.6 亿元增加至 2017 年的 72 亿 元,CAGR=29.2%,到 2022 年市场规模预计将达到 266.6 亿元。


1.3 高通量测序(NGS):引领分子诊断走向高端,应用前景广阔

测序技术更迭速度快,二代高通量测序(NGS)为市场商用主流。 1977 年第一代 DNA 测序技术(Sanger 法)发展至今,测序技术经历了第二代高通量测序(NGS)、 第三代单分子测序技术和第四代纳米孔测序技术的发展变革,各代技术应用领域不 尽相同,各有优缺点,目前处于三代技术并存的局面。第一代 Sanger 测序技术具有 测序读长较长、准确率高的优点,但由于通量低、成本高等因素没有得到大规模应用;二代测序技术自 2005 年以来快速发展,凭借高通量、低成本、测序时间端等优势, 在全球测序市场中仍占据主导地位;第三/四代技术在测序流程、测序时间和读长上 进一步优化,在 ctDNA 测序、单细胞测序等也具有明显优势,是未来发展趋势,但 目前由于错误率较高、分析软件不够丰富等原因,商用受到一定限制,未来随着技术 的改善有望进入成熟应用阶段。

 

 

高通量测序技术(NGS)又称为下一代测序技术,是指通过模板 DNA 分子的化学 修饰,将其锚定在纳米孔或微载体芯片上,利用碱基互补配对原理,在 DNA 聚合 酶链反应或 DNA 连接酶反应过程中,通过采集荧光标记信号或化学反应信号,实 现碱基序列的解读,一次性可完成几十万至上百万条序列的测定NGS 技术可提供 满足评估目标靶向基因所需的扩展性、速度和分辨率。可以同时对许多样本中的多个 基因进行评估,如此便可运行多个独立的分析,从而节省时间并降低成本。另外,与 范围更广的方法(如全基因组测序)相比,靶向基因测序生成的数据量更少,更易管 理,因而分析起来更加轻松。


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