震惊!CRISPR新冠检测技术竟然和早孕检测差不多?
来源: 思宇医械观察 作者: 2020年07月16日 10:57
前言 

新冠疫情爆发以来,如何快速高效检测出新冠病毒成了全球关注的焦点。虽然基于血清学的检测快速且仅需要少量的设备,但由于患者可能在症状发作之后的数天甚至数周才会产生可检测的抗体,所以其实用性有限。而目前全球大量科研团队都在研究和开发基于CRISPR-Cas9的新冠病毒检测技术,竟然和早孕测试差不多?

 一、CRISPR技术简介

CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制,可用来对抗入侵的病毒降解外源 DNA。该系统由 Cas9核酸酶和确定靶向序列的RNA复合体组成,后者由 crRNA和反式激活 RNA(tracrRNA) 组成。 

二、CRISPR技术的应用

在 实 际 应 用 中,crRNA 和 TracrRNA 可以融合成为一条 RNA( sgRNA) 发挥功能。简化后的 CRISPR/Cas9 系统由两部分组成: Cas9 蛋白和 sgRNA。CRISPR/Cas9 系统的发展彻底改变了人们编辑 DNA 序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。该系统作用原理为 sgRNA 通过自身的 Cas9 把手与 Cas9 蛋白形成 Cas9-sgRNA 复合体,Cas9-sgRNA 复合体中 sgRNA 的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9 利用自身的核酸内切酶活性对目标 DNA 序列进行切割。
与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9 系统具有几大明显的优势:成本低廉、构建简单、操作方便、覆盖大多数区域。该技术也常用于基因敲除、基因替换、基因激活、基因治疗、疾病模型构建等方面。
三、在研基于CRISPER技术的SARS-CoV-2检测技术

目前在研的基于CRISPR-Cas9技术的SARS-CoV-2检测项目如下图所示。分别是HERLOCK Bioscience开发的SHERLOCK技术,Mammoth Biosciences开发的DETECTR技术,康涅尼格大学研究人员开发的AIOD技术,加州大学圣芭芭拉分校研究人员开发的CREST技术印度CSIR基因及整合生物学研究所研究人员开发的FELUDA技术。

       

1、SHERLOCK

SHERLOCK是由Sherlock Biosciences和MIT联合开发的一项新冠检测技术,Sherlock Biosciences是2019年3月创立的一家生物技术公司,该公司由张锋等9位在CRISPR技术领域和癌症、传染疾病诊断技术领域的专家共同创立,核心技术由麻省理工学院和哈佛大学授权,分别是基于基因编辑技术CRISPR的诊断技术平台SHERLOCK,和基于合成生物学的分子诊断平台INSPECTR。 2020年2月,张锋教授和他的合作伙伴宣布开发出一项基于CRISPR的新冠病毒检测技术,不需要复杂的设备,三步检测仅需约1个小时,就能检查出新冠病毒RNA的存在。SHERLOCK的核心是一种叫做Cas13a的蛋白酶和与其结合的向导RNA。根据新冠病毒的RNA序列,研究人员们精心设计了能够靶向新冠病毒特异性序列的向导RNA。
理论上讲,只要样本里有新冠病毒所对应的RNA,向导RNA就能对其进行精准的识别,并激活与其结合的Cas13a蛋白酶。Cas13a一旦被激活,它就会切开所遇到的任何RNA分子。也正是利用这种特性,研究人员们在样本里还会添加一种通过RNA相连接的特殊分子。一旦Cas13a得到激活,这种特殊分子上的RNA就会被切断。这样一来,通过确认这些分子有没有被切断,我们就能知道最初的样本里有没有新冠病毒的存在。

后续的检测步骤与市场上的怀孕检测很相似,将反应后的样本滴在能够识别“完整分子”和“切断分子”的试纸上,如果样本里不存在新冠病毒,那么试纸标识“完整分子”的较低位置上,就会出现一条条带。相反,如果样本里真的有新冠病毒对应的RNA,那么在代表“切断分子”的较高位置上,会出现另一条条带。通过条带位置的不同,我们很容易就能确认新冠病毒的存在与否。 该团队在2020年5月发布了一个更新的检测方法:一步 STOPCovid,这款最新的检测手段比2月份的检测技术更进一步,检测过程中不需要从患者样本中纯化RNA,并且将检测新冠病毒所需的化学反应步骤在一个试管中完成。在检验12个新冠病毒阳性和5个新冠病毒阴性样本的实验中,这一检测达到100%的特异性和97%的灵敏度。不过科学家们也强调,这一检测方法还没有获得FDA的批准,尚不能用于临床上对新冠病毒感染的诊断。一步 STOPCovid 试验示意图:

       

该团队还进一步设计了可用于读取 STOPCovid 试验结果的设备盒:取样至反应管,将密封的反应管置于检测盒,用户关闭检测盒并拉动手柄,样本在侧向层析条上发生反应进行检测,应用手机APP获取条带定量强度和相应测试结果。       


该方法的优点在于:在 crRNA/靶基因复合体中存在两个或多个错配的情况下,Cas13a 不具有催化活性,所以对于高度相似的病毒不会给出阳性结果。与DETECTR所使用的 Cas12a 不同,Cas13a 对靶位点没有严格的序列偏好,而 Cas12a 需要 PAM进行靶标切割,限制了使用范围。2020 年 5 月 7 日,Sherlock Biosciences宣布其已获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 对其 Sherlock™CRISPR新冠病毒试剂盒的紧急使用授权 (EUA),该试剂盒用于检测引起 COVID-19 的病毒,在大约一小时内提供结果。 2、 DETECTR 新冠病毒

DETECTR是由Mammoth Biosciences和UCSF联合开发的一项新冠检测技术,Mammoth Biosciences是一家美国生物技术公司,它由CRISPR大神Jennifer Doudna创办,该公司的目标是使其CRISPR驱动的搜索引擎成为疾病检测的首选平台。2020年四月,根据发表在《自然-生物技术》的一篇研究论文显示,Mammoth Biosciences和加州大学旧金山分校(UCSF)的科研团队合作开发出一种基于CRISPR技术的诊断工具,可以快速检测出患者体内是否有新冠病毒。论文指出,使用这一技术大约只需45分钟就能给出结果,相比之下,目前基于PCR的核酸检测需要几小时甚至几天才能出结果,因此新技术可以大大缩短诊断时间。其检测步骤和原理如下图所示:

 

在检测的 83 份已知 COVID 阳性样本中,DETECTR 的阳性预测率为 95%,阴性预测率为 100%。它也是迄今检测速度最快的测方法。此法需要进行RNA的提取,Lucia等研究人员对类似的方法进行了优化,可直接使用唾液检测新冠病毒病毒,无需进行 RNA 提取,但仅当唾液中病毒载量足够高(105 拷贝/μl)时才可能起作用。Mammoth Biosciences日前表示正在与GSK Consumer Healthcare合作,一起将其基于CRISPR的DETECTR平台设计和制造成一次性家庭测试套件,该套件制造计划在2020年底前完成。并在今年年底之前将向美国FDA递交紧急使用授权(EUA)的申请。

 3、AIOD

该技术是由康涅尼格大学生物医学工程系的Changchun Liu教授团队发明。其检测步骤和原理如下:

       

该方法与 SHERLOCK 诊断检测高度相似,在步骤的顺序和使用的 Cas 蛋白方面存在差异。该方法的优点在于检测时反应所需的所有组分混合放置于同一反应体系中,并在单一温度下孵育。本检测方法中设计了两个 Cas12a-crRNA 复合物,使用两个与两个区域结合的 crRNAs 提高了检测的灵敏度。且该反应不受 Cas12a 的前间隔区相邻基序 (PAM) 的限制。该体系具有接近单分子水平的敏感性。以 HIV-1 和新冠病毒检测为例,未经预扩增的 AIOD检测体系能够在 40 min 的孵育中检测低至 1.2 拷贝的 DNA 靶标和 4.6 拷贝的 RNA 靶标。

4、CREST 

该技术是由加州大学圣芭芭拉分校分子细胞生物学系的Max Wilson,Diego Acosta-Alvear, Carolina Arias教授团队共同发明。其检测步骤和原理如下:

       

该技术使用PCR扩增逆转录 RNA 样本,本检测方法没有使用典型的 PCR 仪,而是使用以电池供电通过蓝牙即可以启用的简易PCR 仪。

 5、 FELUDA 

该技术是由印度CSIR基因及整合生物学研究所的Souvik Maiti 和Debojyoti Chakraborty研究员共同开发。FELUDA是一种基于FnCas9 的CRISPR技术,FnCas9 是一种对 DNA 内是否存在错配以及这些错配的位置高度敏感的蛋白。当存在两个及以上的碱基错配时, FnCas9 将不会对靶基因序列进行切割。其检测步骤和原理如下:

       

该方法依赖于其对目标区域的活性,FnCas9 可在 10-50 ℃ 之间变化的温度范围内进行切割。

 6、五种检测方法比较: 

      

结语

在以往的大流行病中,缺乏快速、便捷和准确的诊断测试技术,是阻碍公共卫生部门应对和控制新出现的病毒威胁的主要原因之一。如何开发具有经济实惠,快速便捷特性的诊断工具,成为我们应对当下正在流行的COVID-19和未来可能突发的公共卫生事件的决胜步骤。基于CRISPR的诊断工具由于其具有准确便捷迅速的特点,可以在几天内进行重新配置以检测目标病毒。针对这一技术开发的诊断方法很有可能会改变以前流行病学检测的方法。
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